Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of Compatibiliteitsmodus uit te schakelen in Internet Explorer).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Toont een carrousel van drie dia's tegelijk.Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifknoppen aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Met de ontwikkeling van nieuwe ultrazachte materialen voor medische hulpmiddelen en biomedische toepassingen, is de uitgebreide karakterisering van hun fysieke en mechanische eigenschappen zowel belangrijk als uitdagend.Een gemodificeerde atomaire krachtmicroscopie (AFM) nano-indentatietechniek werd toegepast om de extreem lage oppervlaktemodulus van de nieuwe lehfilcon A biomimetische siliconen hydrogel contactlens gecoat met een laag vertakte polymeerborstelstructuren te karakteriseren.Deze methode maakt nauwkeurige bepaling van contactpunten mogelijk zonder de effecten van stroperige extrusie bij het naderen van vertakte polymeren.Bovendien maakt het het mogelijk om de mechanische eigenschappen van individuele borstelelementen te bepalen zonder het effect van poro-elasticiteit.Dit wordt bereikt door een AFM-sonde te selecteren met een ontwerp (tipgrootte, geometrie en veerconstante) dat bijzonder geschikt is voor het meten van de eigenschappen van zachte materialen en biologische monsters.Deze methode verbetert de gevoeligheid en nauwkeurigheid voor nauwkeurige metingen van het zeer zachte materiaal lehfilcon A, dat een extreem lage elasticiteitsmodulus op het oppervlak heeft (tot 2 kPa) en een extreem hoge elasticiteit in de interne (bijna 100%) waterige omgeving .De resultaten van de oppervlaktestudie onthulden niet alleen de ultrazachte oppervlakte-eigenschappen van de lehfilcon A-lens, maar toonden ook aan dat de modulus van de vertakte polymeerborstels vergelijkbaar was met die van het silicium-waterstofsubstraat.Deze oppervlaktekarakteriseringstechniek kan worden toegepast op andere ultrazachte materialen en medische hulpmiddelen.
De mechanische eigenschappen van materialen die ontworpen zijn voor direct contact met levend weefsel worden vaak bepaald door de biologische omgeving.De perfecte afstemming van deze materiaaleigenschappen helpt om de gewenste klinische kenmerken van het materiaal te bereiken zonder ongunstige cellulaire reacties te veroorzaken1,2,3.Voor bulk homogene materialen is de karakterisering van mechanische eigenschappen relatief eenvoudig vanwege de beschikbaarheid van standaardprocedures en testmethoden (bijv. micro-indentatie4,5,6).Voor ultrazachte materialen zoals gels, hydrogels, biopolymeren, levende cellen enz. zijn deze testmethoden over het algemeen echter niet toepasbaar vanwege beperkingen in de meetresolutie en de inhomogeniteit van sommige materialen7.In de loop der jaren zijn traditionele indrukkingsmethoden gewijzigd en aangepast om een ​​breed scala aan zachte materialen te karakteriseren, maar veel methoden hebben nog steeds ernstige tekortkomingen die hun gebruik beperken8,9,10,11,12,13.Het ontbreken van gespecialiseerde testmethoden die de mechanische eigenschappen van superzachte materialen en oppervlaktelagen nauwkeurig en betrouwbaar kunnen karakteriseren, beperkt hun gebruik in verschillende toepassingen ernstig.
In ons vorige werk introduceerden we de lehfilcon A (CL) contactlens, een zacht heterogeen materiaal met alle ultrazachte oppervlakte-eigenschappen afgeleid van potentieel biomimetische ontwerpen geïnspireerd op het oppervlak van het hoornvlies van het oog.Dit biomateriaal is ontwikkeld door een vertakte, verknoopte polymeerlaag van poly(2-methacryloyloxyethylfosforylcholine (MPC)) (PMPC) te enten op een siliconen hydrogel (SiHy) 15 ontworpen voor medische hulpmiddelen op basis van.Dit entproces creëert een laag op het oppervlak die bestaat uit een zeer zachte en zeer elastische vertakte polymere borstelstructuur.Ons eerdere werk heeft bevestigd dat de biomimetische structuur van lehfilcon A CL superieure oppervlakte-eigenschappen biedt, zoals verbeterde bevochtiging en vervuilingspreventie, verhoogde smering en verminderde cel- en bacteriële adhesie .Daarnaast suggereert het gebruik en de ontwikkeling van dit biomimetische materiaal ook een verdere uitbreiding naar andere biomedische apparaten.Daarom is het van cruciaal belang om de oppervlakte-eigenschappen van dit ultrazachte materiaal te karakteriseren en de mechanische interactie met het oog te begrijpen om een ​​uitgebreide kennisbasis te creëren ter ondersteuning van toekomstige ontwikkelingen en toepassingen.De meeste in de handel verkrijgbare SiHy-contactlenzen zijn samengesteld uit een homogeen mengsel van hydrofiele en hydrofobe polymeren die een uniforme materiaalstructuur vormen17.Er zijn verschillende onderzoeken uitgevoerd om hun mechanische eigenschappen te onderzoeken met behulp van traditionele compressie-, trek- en micro-indentatietestmethoden18,19,20,21.Het nieuwe biomimetische ontwerp van lehfilcon A CL maakt het echter een uniek heterogeen materiaal waarin de mechanische eigenschappen van de vertakte polymeerborstelstructuren aanzienlijk verschillen van die van het SiHy-basissubstraat.Daarom is het erg moeilijk om deze eigenschappen nauwkeurig te kwantificeren met behulp van conventionele en indentatiemethoden.Een veelbelovende methode maakt gebruik van de nano-indentatietestmethode die is geïmplementeerd in atomaire krachtmicroscopie (AFM), een methode die is gebruikt om de mechanische eigenschappen van zachte visco-elastische materialen zoals biologische cellen en weefsels, evenals zachte polymeren te bepalen22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.Bij AFM-nano-indentatie worden de basisprincipes van nano-indentatietesten gecombineerd met de nieuwste ontwikkelingen in AFM-technologie om een ​​verhoogde meetgevoeligheid en testen van een breed scala aan inherent superzachte materialen31,32,33,34,35,36 te bieden.Daarnaast biedt de technologie andere belangrijke voordelen door het gebruik van verschillende geometrieën.indenter en sonde en de mogelijkheid om te testen in verschillende vloeibare media.
AFM-nano-indentatie kan voorwaardelijk worden onderverdeeld in drie hoofdcomponenten: (1) apparatuur (sensoren, detectoren, sondes, enz.);(2) meetparameters (zoals kracht, verplaatsing, snelheid, hellingsgrootte, enz.);(3) Gegevensverwerking (basislijncorrectie, schatting van het aanraakpunt, gegevensaanpassing, modellering, enz.).Een belangrijk probleem met deze methode is dat verschillende studies in de literatuur die gebruik maken van AFM-nano-indentatie zeer verschillende kwantitatieve resultaten rapporteren voor hetzelfde monster/cel/materiaaltype37,38,39,40,41.Lekka et al.De invloed van AFM-sondegeometrie op de gemeten Young's modulus van monsters van mechanisch homogene hydrogel en heterogene cellen werd bestudeerd en vergeleken.Ze rapporteren dat moduluswaarden sterk afhankelijk zijn van de selectie van de cantilever en de vorm van de punt, met de hoogste waarde voor een piramidevormige sonde en de laagste waarde van 42 voor een bolvormige sonde.Evenzo hebben Selhuber-Unkel et al.Er is aangetoond hoe de snelheid van de indenter, de grootte van de indenter en de dikte van polyacrylamide (PAAM) monsters de Young's modulus beïnvloeden, gemeten door ACM43 nano-indentatie.Een andere complicerende factor is het ontbreken van standaard testmaterialen met extreem lage modulus en gratis testprocedures.Dit maakt het erg moeilijk om met vertrouwen nauwkeurige resultaten te krijgen.De methode is echter erg handig voor relatieve metingen en vergelijkende evaluaties tussen vergelijkbare monstertypes, bijvoorbeeld met behulp van AFM-nano-indentatie om normale cellen te onderscheiden van kankercellen 44, 45.
Bij het testen van zachte materialen met AFM-nano-indentatie is een algemene vuistregel het gebruik van een sonde met een lage veerconstante (k) die nauw overeenkomt met de monstermodulus en een halfbolvormige/ronde punt zodat de eerste sonde de monsteroppervlakken niet doorboort. eerste contact met zachte materialen.Het is ook belangrijk dat het afbuigsignaal dat door de sonde wordt gegenereerd, sterk genoeg is om te worden gedetecteerd door het laserdetectorsysteem24,34,46,47.In het geval van ultrazachte heterogene cellen, weefsels en gels is een andere uitdaging het overwinnen van de kleefkracht tussen de sonde en het monsteroppervlak om reproduceerbare en betrouwbare metingen te garanderen48,49,50.Tot voor kort was het meeste werk aan AFM-nano-indentatie gericht op de studie van het mechanische gedrag van biologische cellen, weefsels, gels, hydrogels en biomoleculen met behulp van relatief grote bolvormige sondes, gewoonlijk colloïdale sondes (CP's) genoemd., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Deze tips hebben een straal van 1 tot 50 µm en zijn meestal gemaakt van borosilicaatglas, polymethylmethacrylaat (PMMA), polystyreen (PS), siliciumdioxide (SiO2) en diamant- zoals koolstof (DLC).Hoewel CP-AFM-nano-indentatie vaak de eerste keuze is voor de karakterisering van zachte monsters, heeft het zijn eigen problemen en beperkingen.Het gebruik van grote bolvormige tips van micronformaat vergroot het totale contactoppervlak van de tip met het monster en resulteert in een aanzienlijk verlies aan ruimtelijke resolutie.Voor zachte, inhomogene monsters, waar de mechanische eigenschappen van lokale elementen aanzienlijk kunnen verschillen van het gemiddelde over een groter gebied, kan CP-inkeping elke inhomogeniteit in eigenschappen op lokale schaal verbergen52.Colloïdale sondes worden meestal gemaakt door colloïdale bollen van micronformaat aan tiploze cantilevers te bevestigen met behulp van epoxykleefstoffen.Het fabricageproces zelf is beladen met veel problemen en kan leiden tot inconsistenties in het kalibratieproces van de sonde.Bovendien hebben de grootte en massa van colloïdale deeltjes rechtstreeks invloed op de belangrijkste kalibratieparameters van de cantilever, zoals resonantiefrequentie, veerstijfheid en afbuiggevoeligheid56,57,58.Veelgebruikte methoden voor conventionele AFM-sondes, zoals temperatuurkalibratie, bieden dus mogelijk geen nauwkeurige kalibratie voor CP, en er kunnen andere methoden nodig zijn om deze correcties uit te voeren57, 59, 60, 61. Typische CP-inspringingsexperimenten gebruiken grote afwijkingen cantilever om bestudeer de eigenschappen van zachte monsters, wat een ander probleem veroorzaakt bij het kalibreren van het niet-lineaire gedrag van de cantilever bij relatief grote afwijkingen62,63,64.Moderne methoden voor het inspringen van colloïdale sondes houden meestal rekening met de geometrie van de cantilever die wordt gebruikt om de sonde te kalibreren, maar negeren de invloed van colloïdale deeltjes, wat extra onzekerheid creëert in de nauwkeurigheid van de methode38,61.Evenzo zijn elastische moduli die worden berekend door het passen van het contactmodel rechtstreeks afhankelijk van de geometrie van de inspringende sonde, en een verkeerde combinatie tussen de eigenschappen van de tip en het monsteroppervlak kan leiden tot onnauwkeurigheden . Recent werk van Spencer et al.De factoren waarmee rekening moet worden gehouden bij het karakteriseren van zachte polymeerborstels met behulp van de CP-AFM nano-indentatiemethode worden benadrukt.Ze meldden dat het vasthouden van een stroperige vloeistof in polymeerborstels als functie van snelheid resulteert in een toename van de kopbelasting en dus in verschillende metingen van snelheidsafhankelijke eigenschappen30,69,70,71.
In deze studie hebben we de oppervlaktemodulus van het ultrazachte, zeer elastische materiaal lehfilcon A CL gekarakteriseerd met behulp van een gemodificeerde AFM nano-indentatiemethode.Gezien de eigenschappen en nieuwe structuur van dit materiaal, is het gevoeligheidsbereik van de traditionele indentatiemethode duidelijk onvoldoende om de modulus van dit extreem zachte materiaal te karakteriseren, dus is het noodzakelijk om een ​​AFM-nano-indentatiemethode te gebruiken met hogere gevoeligheid en lagere gevoeligheid.niveau.Na het bekijken van de tekortkomingen en problemen van bestaande colloïdale AFM-sonde nano-indentatietechnieken, laten we zien waarom we een kleinere, op maat ontworpen AFM-sonde hebben gekozen om gevoeligheid, achtergrondruis, nauwkeurig contactpunt te elimineren, snelheidsmodulus te meten van zachte heterogene materialen zoals vochtretentie afhankelijkheid.en nauwkeurige kwantificering.Bovendien konden we de vorm en afmetingen van de inkepingstip nauwkeurig meten, waardoor we het cone-sphere fit-model konden gebruiken om de elasticiteitsmodulus te bepalen zonder het contactoppervlak van de punt met het materiaal te beoordelen.De twee impliciete aannames die in dit werk worden gekwantificeerd, zijn de volledig elastische materiaaleigenschappen en de inspringdiepte-onafhankelijke modulus.Met behulp van deze methode hebben we eerst ultrazachte standaarden getest met een bekende modulus om de methode te kwantificeren, en vervolgens hebben we deze methode gebruikt om de oppervlakken van twee verschillende contactlensmaterialen te karakteriseren.Deze methode voor het karakteriseren van AFM-nano-indentatie-oppervlakken met verhoogde gevoeligheid zal naar verwachting toepasbaar zijn op een breed scala aan biomimetische heterogene ultrazachte materialen met mogelijk gebruik in medische hulpmiddelen en biomedische toepassingen.
Lehfilcon A-contactlenzen (Alcon, Fort Worth, Texas, VS) en hun siliconenhydrogelsubstraten werden gekozen voor nano-indentatie-experimenten.Bij het experiment werd een speciaal ontworpen lensvatting gebruikt.Om de lens voor het testen te installeren, werd deze zorgvuldig op de koepelvormige standaard geplaatst, ervoor zorgend dat er geen luchtbellen in kwamen, en vervolgens met de randen vastgezet.Een gat in het armatuur aan de bovenkant van de lenshouder biedt toegang tot het optische midden van de lens voor nano-indentatie-experimenten terwijl de vloeistof op zijn plaats wordt gehouden.Hierdoor blijven de lenzen volledig gehydrateerd.Als testoplossing werd 500 μl verpakkingsoplossing voor contactlenzen gebruikt.Om de kwantitatieve resultaten te verifiëren, werden in de handel verkrijgbare niet-geactiveerde polyacrylamide (PAAM) hydrogels bereid uit een polyacrylamide-co-methyleen-bisacrylamide-samenstelling (100 mm Petrisoft petrischalen, Matrigen, Irvine, CA, VS), een bekende elasticiteitsmodulus van 1 kPa.Gebruik 4-5 druppels (ongeveer 125 µl) fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS van Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, VS) en 1 druppel OPTI-FREE Puremoist contactlensoplossing (Alcon, Vaud, TX, VS).) op de AFM hydrogel-probe-interface.
Monsters van Lehfilcon A CL- en SiHy-substraten werden gevisualiseerd met behulp van een FEI Quanta 250 Field Emission Scanning Electron Microscope (FEG SEM) -systeem uitgerust met een Scanning Transmission Electron Microscope (STEM) -detector.Om de monsters voor te bereiden, werden de lenzen eerst gewassen met water en in taartvormige wiggen gesneden.Om een ​​differentieel contrast tussen de hydrofiele en hydrofobe componenten van de monsters te bereiken, werd een 0,10% gestabiliseerde oplossing van RuO4 als kleurstof gebruikt, waarin de monsters gedurende 30 minuten werden ondergedompeld.De lehfilcon A CL RuO4-kleuring is niet alleen belangrijk om een ​​verbeterd differentieel contrast te bereiken, maar helpt ook om de structuur van de vertakte polymeerborstels in hun oorspronkelijke vorm te behouden, die vervolgens zichtbaar zijn op STEM-afbeeldingen.Vervolgens werden ze gewassen en gedehydrateerd in een reeks ethanol/water-mengsels met toenemende ethanolconcentratie.De monsters werden vervolgens gegoten met EMBed 812/Araldite epoxy, die overnacht uithardde bij 70°C.Monsterblokken verkregen door harspolymerisatie werden gesneden met een ultramicrotoom en de resulterende dunne secties werden gevisualiseerd met een STEM-detector in laagvacuümmodus bij een versnellingsspanning van 30 kV.Hetzelfde SEM-systeem werd gebruikt voor gedetailleerde karakterisering van de PFQNM-LC-A-CAL AFM-sonde (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, VS).SEM-beelden van de AFM-sonde werden verkregen in een typische hoogvacuümmodus met een versnellingsspanning van 30 kV.Verkrijg beelden onder verschillende hoeken en vergrotingen om alle details van de vorm en grootte van de AFM-sondetip vast te leggen.Alle tipafmetingen van belang in de afbeeldingen werden digitaal gemeten.
Een Dimension FastScan Bio Icon atoomkrachtmicroscoop (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, VS) met "PeakForce QNM in Fluid" -modus werd gebruikt om lehfilcon A CL-, SiHy-substraat- en PAAm-hydrogelmonsters te visualiseren en nano-indentate.Voor beeldvormingsexperimenten werd een PEAKFORCE-HIRS-FA-sonde (Bruker) met een nominale puntradius van 1 nm gebruikt om beelden met een hoge resolutie van het monster vast te leggen met een scansnelheid van 0,50 Hz.Alle afbeeldingen zijn gemaakt in waterige oplossing.
AFM nano-indentatie-experimenten werden uitgevoerd met behulp van een PFQNM-LC-A-CAL-sonde (Bruker).De AFM-sonde heeft een siliciumpunt op een nitride cantilever van 345 nm dik, 54 µm lang en 4,5 µm breed met een resonantiefrequentie van 45 kHz.Het is specifiek ontworpen om kwantitatieve nanomechanische metingen op zachte biologische monsters te karakteriseren en uit te voeren.De sensoren zijn individueel gekalibreerd in de fabriek met voorgekalibreerde veerinstellingen.De veerconstanten van de sondes die in deze studie werden gebruikt, lagen tussen 0,05 en 0,1 N/m.Om de vorm en grootte van de punt nauwkeurig te bepalen, werd de sonde in detail gekarakteriseerd met behulp van SEM.Op afb.Afbeelding 1a toont een scanning-elektronenmicroscoopfoto met hoge resolutie en lage vergroting van de PFQNM-LC-A-CAL-sonde, die een holistisch beeld geeft van het ontwerp van de sonde.Op afb.1b toont een vergroot aanzicht van de bovenkant van de sondetip en geeft informatie over de vorm en grootte van de punt.Aan het uiterste uiteinde is de naald een halve bol met een diameter van ongeveer 140 nm (fig. 1c).Daaronder loopt de punt taps toe tot een conische vorm en bereikt een gemeten lengte van ongeveer 500 nm.Buiten het taps toelopende gebied is de tip cilindrisch en eindigt in een totale tiplengte van 1,18 µm.Dit is het belangrijkste functionele onderdeel van de sondetip.Bovendien werd een grote bolvormige polystyreen (PS) sonde (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, VS) met een puntdiameter van 45 µm en een veerconstante van 2 N/m ook gebruikt voor het testen als een colloïdale sonde.met PFQNM-LC-A-CAL 140 nm sonde ter vergelijking.
Er is gemeld dat vloeistof kan worden opgesloten tussen de AFM-sonde en de polymeerborstelstructuur tijdens nano-indentatie, wat een opwaartse kracht op de AFM-sonde zal uitoefenen voordat deze daadwerkelijk het oppervlak raakt69.Dit stroperige extrusie-effect als gevolg van vochtretentie kan het schijnbare contactpunt veranderen, waardoor metingen van de oppervlaktemodulus worden beïnvloed.Om het effect van de geometrie van de sonde en de indrukkingssnelheid op vloeistofretentie te bestuderen, werden indrukkingskrachtcurven uitgezet voor lehfilcon A CL-monsters met behulp van een sonde met een diameter van 140 nm bij constante verplaatsingssnelheden van 1 µm/s en 2 µm/s.sondediameter 45 µm, vaste krachtinstelling 6 nN bereikt bij 1 µm/s.Experimenten met een sonde met een diameter van 140 nm werden uitgevoerd met een indrukkingssnelheid van 1 µm/s en een ingestelde kracht van 300 pN, gekozen om een ​​contactdruk te creëren binnen het fysiologische bereik (1–8 kPa) van het bovenste ooglid.druk 72. Zachte kant-en-klare monsters PAA-hydrogel met een druk van 1 kPa werden getest op een indrukkracht van 50 pN bij een snelheid van 1 μm/s met een sonde met een diameter van 140 nm.
Aangezien de lengte van het conische deel van de punt van de PFQNM-LC-A-CAL-sonde ongeveer 500 nm is, kan voor elke indrukkingsdiepte < 500 nm veilig worden aangenomen dat de geometrie van de sonde tijdens het inspringen trouw blijft aan zijn kegelvorm.Bovendien wordt aangenomen dat het oppervlak van het te testen materiaal een omkeerbare elastische respons zal vertonen, wat ook in de volgende paragrafen zal worden bevestigd.Daarom kozen we, afhankelijk van de vorm en grootte van de punt, voor het door Briscoe, Sebastian en Adams ontwikkelde kegel-bol-fittingmodel, dat beschikbaar is in de software van de leverancier, om onze AFM nano-indentatie-experimenten (NanoScope) te verwerken.Separation data analysis software, Bruker) 73. Het model beschrijft de kracht-verplaatsingsrelatie F(δ) voor een kegel met een sferisch topdefect.Op afb.Figuur 2 toont de contactgeometrie tijdens de interactie van een stijve kegel met een bolvormige punt, waarbij R de straal van de bolvormige punt is, a de contactstraal is, b de contactstraal aan het einde van de bolvormige punt is, δ de contactradius.inspringdiepte, θ is de halve hoek van de kegel.Het SEM-beeld van deze sonde laat duidelijk zien dat de sferische punt met een diameter van 140 nm tangentieel overgaat in een kegel, dus hier wordt b alleen gedefinieerd door R, dwz b = R cos θ.De door de leverancier geleverde software biedt een kegel-bol-relatie om Young's modulus (E)-waarden te berekenen op basis van krachtscheidingsgegevens, uitgaande van a > b.Relatie:
waar F de indrukkingskracht is, E de Young-modulus is, ν de Poisson-verhouding is.De contactradius a kan worden geschat met:
Schema van de contactgeometrie van een stijve kegel met een bolvormige punt gedrukt in het materiaal van een Lefilcon-contactlens met een oppervlaktelaag van vertakte polymeerborstels.
Als a ≤ b, reduceert de relatie tot de vergelijking voor een conventionele bolvormige indenter;
Wij geloven dat de interactie van de inspringende sonde met de vertakte structuur van de PMPC-polymeerborstel ervoor zal zorgen dat de contactstraal a groter is dan de sferische contactstraal b.Daarom hebben we voor alle kwantitatieve metingen van de elasticiteitsmodulus die in deze studie zijn uitgevoerd, de afhankelijkheid gebruikt die is verkregen voor het geval a > b.
De ultrazachte biomimetische materialen die in deze studie zijn bestudeerd, werden uitgebreid afgebeeld met behulp van scanning transmissie-elektronenmicroscopie (STEM) van de dwarsdoorsnede van het monster en atoomkrachtmicroscopie (AFM) van het oppervlak.Deze gedetailleerde karakterisering van het oppervlak werd uitgevoerd als een uitbreiding van ons eerder gepubliceerde werk, waarin we vaststelden dat de dynamisch vertakte polymere borstelstructuur van het PMPC-gemodificeerde lehfilcon A CL-oppervlak vergelijkbare mechanische eigenschappen vertoonde als natuurlijk hoornvliesweefsel 14 .Om deze reden noemen we contactlensoppervlakken biomimetische materialen14.Op afb.3a,b tonen dwarsdoorsneden van vertakte PMPC-polymeerborstelstructuren op het oppervlak van respectievelijk een lehfilcon A CL-substraat en een onbehandeld SiHy-substraat.De oppervlakken van beide monsters werden verder geanalyseerd met behulp van AFM-afbeeldingen met hoge resolutie, die de resultaten van de STEM-analyse verder bevestigden (Fig. 3c, d).Bij elkaar genomen geven deze afbeeldingen een geschatte lengte van de PMPC-vertakte polymeerborstelstructuur bij 300-400 nm, wat van cruciaal belang is voor het interpreteren van AFM-nano-indentatiemetingen.Een andere belangrijke observatie die uit de afbeeldingen is afgeleid, is dat de algehele oppervlaktestructuur van het CL-biomimetische materiaal morfologisch verschilt van die van het SiHy-substraatmateriaal.Dit verschil in hun oppervlaktemorfologie kan duidelijk worden tijdens hun mechanische interactie met de inspringende AFM-sonde en vervolgens in de gemeten moduluswaarden.
STEM-beelden in dwarsdoorsnede van (a) lehfilcon A CL en (b) SiHy-substraat.Schaalbalk, 500 nm.AFM-afbeeldingen van het oppervlak van het lehfilcon A CL-substraat (c) en het SiHy-basissubstraat (d) (3 µm × 3 µm).
Bio-geïnspireerde polymeren en polymeerborstelstructuren zijn inherent zacht en zijn uitgebreid bestudeerd en gebruikt in verschillende biomedische toepassingen74,75,76,77.Daarom is het belangrijk om de AFM nano-indentatiemethode te gebruiken, die hun mechanische eigenschappen nauwkeurig en betrouwbaar kan meten.Maar tegelijkertijd maken de unieke eigenschappen van deze ultrazachte materialen, zoals een extreem lage elasticiteitsmodulus, een hoog vloeistofgehalte en een hoge elasticiteit, het vaak moeilijk om het juiste materiaal, de vorm en vorm van de indenting probe te kiezen.maat.Dit is belangrijk zodat de indenter het zachte oppervlak van het monster niet doorboort, wat zou leiden tot fouten bij het bepalen van het contactpunt met het oppervlak en het contactgebied.
Hiervoor is een uitgebreid begrip van de morfologie van ultrazachte biomimetische materialen (lehfilcon A CL) essentieel.Informatie over de grootte en structuur van de vertakte polymeerborstels verkregen met behulp van de beeldvormingsmethode vormt de basis voor de mechanische karakterisering van het oppervlak met behulp van AFM nano-indentatietechnieken.In plaats van sferische colloïdale sondes ter grootte van een micron, kozen we voor de PFQNM-LC-A-CAL siliciumnitride-sonde (Bruker) met een tipdiameter van 140 nm, speciaal ontworpen voor het kwantitatief in kaart brengen van de mechanische eigenschappen van biologische monsters 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 De grondgedachte voor het gebruik van relatief scherpe sondes in vergelijking met conventionele colloïdale sondes kan worden verklaard door de structurele kenmerken van het materiaal.Door de grootte van de sondetip (~ 140 nm) te vergelijken met de vertakte polymeerborstels op het oppervlak van CL lehfilcon A, getoond in Fig. 3a, kan worden geconcludeerd dat de punt groot genoeg is om in direct contact te komen met deze borstelstructuren, die verkleint de kans dat de punt er doorheen prikt.Om dit punt te illustreren, is in Fig. 4 een STEM-afbeelding van de lehfilcon A CL en de inspringende punt van de AFM-sonde (op schaal getekend).
Schematische weergave van STEM-afbeelding van lehfilcon A CL en een ACM-inspringsonde (op schaal getekend).
Bovendien is de tipgrootte van 140 nm klein genoeg om het risico van een van de kleverige extrusie-effecten te vermijden die eerder zijn gerapporteerd voor polymeerborstels geproduceerd door de CP-AFM nano-indentatiemethode69,71.We nemen aan dat vanwege de speciale kegel-bolvorm en relatief kleine afmeting van deze AFM-tip (Fig. 1), de aard van de krachtcurve die wordt gegenereerd door lehfilcon A CL nano-indentatie niet afhangt van de indentatiesnelheid of de laad- / lossnelheid .Daarom wordt het niet beïnvloed door poro-elastische effecten.Om deze hypothese te testen, werden lehfilcon A CL-monsters ingesprongen met een vaste maximale kracht met behulp van een PFQNM-LC-A-CAL-sonde, maar met twee verschillende snelheden, en de resulterende trek- en terugtrekkrachtcurven werden gebruikt om de kracht (nN) uit te zetten. in scheiding (μm) wordt weergegeven in figuur 5a.Het is duidelijk dat de krachtkrommen tijdens het laden en lossen elkaar volledig overlappen, en er is geen duidelijk bewijs dat de krachtafschuiving bij nul indrukkingsdiepte toeneemt met de indrukkingssnelheid in de figuur, wat suggereert dat de individuele borstelelementen werden gekarakteriseerd zonder een poro-elastisch effect.Daarentegen zijn vloeistofretentie-effecten (viskeuze extrusie en poro-elasticiteitseffecten) duidelijk voor de AFM-sonde met een diameter van 45 μm bij dezelfde inspringsnelheid en worden benadrukt door de hysteresis tussen de rek- en terugtrekcurven, zoals weergegeven in figuur 5b.Deze resultaten ondersteunen de hypothese en suggereren dat sondes met een diameter van 140 nm een ​​goede keuze zijn voor het karakteriseren van dergelijke zachte oppervlakken.
lehfilcon A CL inspringkrachtcurven met behulp van ACM;(a) het gebruik van een sonde met een diameter van 140 nm bij twee laadsnelheden, waarmee de afwezigheid van een poro-elastisch effect tijdens het inspringen van het oppervlak wordt aangetoond;(b) het gebruik van sondes met een diameter van 45 µm en 140 nm.s tonen de effecten van stroperige extrusie en poro-elasticiteit voor grote sondes in vergelijking met kleinere sondes.
Om ultrazachte oppervlakken te karakteriseren, moeten AFM-methoden voor nano-indentatie de beste sonde hebben om de eigenschappen van het bestudeerde materiaal te bestuderen.Naast de vorm en grootte van de punt spelen de gevoeligheid van het AFM-detectorsysteem, de gevoeligheid voor puntafbuiging in de testomgeving en vrijdragende stijfheid een belangrijke rol bij het bepalen van de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van nano-indentatie.afmetingen.Voor ons AFM-systeem is de detectielimiet van de positiegevoelige detector (PSD) ongeveer 0,5 mV en is gebaseerd op de vooraf gekalibreerde veerconstante en de berekende vloeistofdeflectiegevoeligheid van de PFQNM-LC-A-CAL-sonde, die overeenkomt met de theoretische belastingsgevoeligheid.kleiner is dan 0,1 pN.Daarom maakt deze methode de meting mogelijk van een minimale indrukkingskracht ≤ 0,1 pN zonder enige perifere ruiscomponent.Het is echter bijna onmogelijk voor een AFM-systeem om omgevingsgeluid tot dit niveau te reduceren vanwege factoren als mechanische trillingen en vloeistofdynamica.Deze factoren beperken de algehele gevoeligheid van de AFM-nano-indentatiemethode en resulteren ook in een achtergrondruissignaal van ongeveer ≤ 10 pN.Voor oppervlaktekarakterisering werden lehfilcon A CL- en SiHy-substraatmonsters ingesprongen onder volledig gehydrateerde omstandigheden met behulp van een 140 nm-sonde voor SEM-karakterisering, en de resulterende krachtcurven werden gesuperponeerd tussen kracht (pN) en druk.De scheidingsplot (μm) wordt weergegeven in figuur 6a.Vergeleken met het SiHy-basissubstraat laat de lehfilcon A CL-krachtcurve duidelijk een overgangsfase zien die begint bij het contactpunt met de gevorkte polymeerborstel en eindigt met een scherpe verandering in het hellingsmarkeringscontact van de punt met het onderliggende materiaal.Dit overgangsdeel van de krachtcurve benadrukt het echt elastische gedrag van de vertakte polymeerborstel op het oppervlak, zoals blijkt uit de compressiecurve die de spanningscurve nauw volgt en het contrast in mechanische eigenschappen tussen de borstelstructuur en het volumineuze SiHy-materiaal.Bij het vergelijken van lefilcon.Scheiding van de gemiddelde lengte van een vertakte polymeerborstel in het STEM-beeld van het PCS (Fig. 3a) en zijn krachtcurve langs de abscis in Fig. 3a.6a laat zien dat de methode in staat is om de punt te detecteren en het vertakte polymeer dat de top van het oppervlak bereikt.Contact tussen borstelstructuren.Bovendien geeft een nauwe overlapping van de krachtcurven aan dat er geen vloeistofretentie-effect is.In dit geval is er absoluut geen adhesie tussen de naald en het oppervlak van het monster.De bovenste secties van de krachtcurven voor de twee monsters overlappen elkaar, wat de gelijkenis van de mechanische eigenschappen van de substraatmaterialen weerspiegelt.
(a) AFM nano-indentatiekrachtkrommen voor lehfilcon A CL-substraten en SiHy-substraten, (b) krachtkrommen die contactpuntschatting tonen met behulp van de achtergrondruisdrempelmethode.
Om de fijnere details van de krachtcurve te bestuderen, is de spanningscurve van het lehfilcon A CL-monster opnieuw uitgezet in figuur 6b met een maximale kracht van 50 pN langs de y-as.Deze grafiek geeft belangrijke informatie over het oorspronkelijke achtergrondgeluid.De ruis ligt in het bereik van ±10 pN, dat wordt gebruikt om het contactpunt nauwkeurig te bepalen en de indrukkingsdiepte te berekenen.Zoals gerapporteerd in de literatuur, is de identificatie van contactpunten van cruciaal belang om materiaaleigenschappen zoals modulus85 nauwkeurig te beoordelen.Een benadering waarbij automatische verwerking van krachtkrommegegevens wordt gebruikt, heeft een verbeterde afstemming aangetoond tussen gegevensaanpassing en kwantitatieve metingen voor zachte materialen86.In dit werk is onze keuze van contactpunten relatief eenvoudig en objectief, maar ze heeft zijn beperkingen.Onze conservatieve benadering voor het bepalen van het contactpunt kan resulteren in iets overschatte moduluswaarden voor kleinere inspringdieptes (< 100 nm).Het gebruik van op algoritmen gebaseerde contactpuntdetectie en geautomatiseerde gegevensverwerking zou in de toekomst een voortzetting van dit werk kunnen zijn om onze methode verder te verbeteren.Voor intrinsieke achtergrondruis in de orde van ±10 pN definiëren we dus het contactpunt als het eerste gegevenspunt op de x-as in figuur 6b met een waarde van ≥10 pN.Vervolgens markeert, in overeenstemming met de ruisdrempel van 10 pN, een verticale lijn op het niveau van ~0,27 µm het contactpunt met het oppervlak, waarna de rekcurve doorgaat totdat het substraat de indrukkingsdiepte van ~270 nm bereikt.Interessant is dat op basis van de grootte van de vertakte polymeerborstelkenmerken (300-400 nm) gemeten met behulp van de beeldvormingsmethode, de inspringdiepte van het CL lehfilcon A-monster waargenomen met behulp van de achtergrondruisdrempelmethode ongeveer 270 nm is, wat zeer dicht bij de meetmaat met STEM.Deze resultaten bevestigen verder de compatibiliteit en toepasbaarheid van de vorm en grootte van de AFM-sondetip voor indrukking van deze zeer zachte en zeer elastische vertakte polymeerborstelstructuur.Deze gegevens bieden ook sterk bewijs ter ondersteuning van onze methode om achtergrondgeluid te gebruiken als drempel voor het lokaliseren van contactpunten.Alle kwantitatieve resultaten die worden verkregen uit wiskundige modellering en aanpassing van de krachtcurve moeten dus relatief nauwkeurig zijn.
Kwantitatieve metingen door AFM-methoden voor nano-indentatie zijn volledig afhankelijk van de wiskundige modellen die worden gebruikt voor gegevensselectie en daaropvolgende analyse.Daarom is het belangrijk om alle factoren in overweging te nemen die verband houden met de keuze van het indenter, materiaaleigenschappen en de mechanica van hun interactie voordat u een bepaald model kiest.In dit geval werd de puntgeometrie zorgvuldig gekarakteriseerd met behulp van SEM-microfoto's (figuur 1), en op basis van de resultaten is de AFM nano-indenting-sonde met een diameter van 140 nm met een harde kegel en bolvormige puntgeometrie een goede keuze voor het karakteriseren van lehfilcon A CL79-monsters .Een andere belangrijke factor die zorgvuldig moet worden geëvalueerd, is de elasticiteit van het te testen polymeermateriaal.Hoewel de initiële gegevens van nano-indentatie (figuren 5a en 6a) duidelijk de kenmerken schetsen van de overlapping van de spannings- en compressiecurven, dwz het volledige elastische herstel van het materiaal, is het uiterst belangrijk om de zuiver elastische aard van de contacten te bevestigen. .Hiertoe werden twee opeenvolgende indrukkingen uitgevoerd op dezelfde plaats op het oppervlak van het lehfilcon A CL-monster met een indrukkingssnelheid van 1 µm/s onder volledige hydratatieomstandigheden.De resulterende krachtkrommegegevens worden getoond in Fig.7 en, zoals verwacht, zijn de uitzettings- en compressiecurven van de twee prints bijna identiek, wat de hoge elasticiteit van de vertakte polymeerborstelstructuur benadrukt.
Twee indrukkingskrachtkrommen op dezelfde plaats op het oppervlak van lehfilcon A CL geven de ideale elasticiteit van het lensoppervlak aan.
Gebaseerd op informatie verkregen uit SEM- en STEM-beelden van respectievelijk de sondepunt en het lehfilcon A CL-oppervlak, is het kegelbolmodel een redelijke wiskundige weergave van de interactie tussen de AFM-sondepunt en het zachte polymeermateriaal dat wordt getest.Bovendien gelden voor dit kegelbolmodel de fundamentele aannames over de elastische eigenschappen van het bedrukte materiaal voor dit nieuwe biomimetische materiaal en worden ze gebruikt om de elasticiteitsmodulus te kwantificeren.
Na een uitgebreide evaluatie van de AFM-methode voor nano-indentatie en zijn componenten, waaronder de eigenschappen van de indentatiesonde (vorm, grootte en veerstijfheid), gevoeligheid (schatting van achtergrondruis en contactpunten) en data-aanpassingsmodellen (kwantitatieve modulusmetingen), werd de methode gebruikt.karakteriseer in de handel verkrijgbare ultrazachte monsters om kwantitatieve resultaten te verifiëren.Een commerciële polyacrylamide (PAAM) hydrogel met een elasticiteitsmodulus van 1 kPa werd getest onder gehydrateerde omstandigheden met behulp van een 140 nm-sonde.Details van het testen en berekenen van modules vindt u in de aanvullende informatie.De resultaten toonden aan dat de gemiddelde gemeten modulus 0,92 kPa was en dat het %RSD en de procentuele (%) afwijking van de bekende modulus minder dan 10% waren.Deze resultaten bevestigen de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de AFM nano-indentatiemethode die in dit werk wordt gebruikt om de moduli van ultrazachte materialen te meten.De oppervlakken van de lehfilcon A CL-monsters en het SiHy-basissubstraat werden verder gekarakteriseerd met behulp van dezelfde AFM-nano-indentatiemethode om de schijnbare contactmodulus van het ultrazachte oppervlak te bestuderen als een functie van de indrukkingsdiepte.Scheidingscurven voor de indrukkingskracht werden gegenereerd voor drie monsters van elk type (n = 3; één indrukking per monster) met een kracht van 300 pN, een snelheid van 1 µm/s en volledige hydratatie.De kromme voor het delen van de inspringingskracht werd benaderd met behulp van een kegelbolmodel.Om een ​​modulus te verkrijgen die afhankelijk is van de indrukkingsdiepte, werd een 40 nm breed deel van de krachtcurve ingesteld bij elke stap van 20 nm vanaf het contactpunt, en gemeten waarden van de modulus bij elke stap van de krachtcurve.Spin Cy et al.Een vergelijkbare benadering is gebruikt om de modulusgradiënt van poly (laurylmethacrylaat) (P12MA) polymeerborstels te karakteriseren met behulp van colloïdale AFM-sonde nano-indentatie, en ze zijn consistent met gegevens met behulp van het Hertz-contactmodel.Deze benadering biedt een grafiek van de schijnbare contactmodulus (kPa) versus de indrukkingsdiepte (nm), zoals weergegeven in figuur 8, die de schijnbare contactmodulus/dieptegradiënt illustreert.De berekende elasticiteitsmodulus van het CL lehfilcon A-monster ligt in het bereik van 2–3 kPa binnen de bovenste 100 nm van het monster, waarboven het begint toe te nemen met de diepte.Aan de andere kant, bij het testen van het SiHy-basissubstraat zonder een borstelachtige film op het oppervlak, is de maximale indrukkingsdiepte die wordt bereikt bij een kracht van 300 pN minder dan 50 nm, en de moduluswaarde verkregen uit de gegevens is ongeveer 400 kPa , wat vergelijkbaar is met de waarden van Young's modulus voor bulkmaterialen.
Schijnbare contactmodulus (kPa) versus inspringdiepte (nm) voor lehfilcon A CL- en SiHy-substraten met behulp van de AFM-nano-indentatiemethode met kegelbolgeometrie om de modulus te meten.
Het bovenste oppervlak van de nieuwe biomimetische vertakte polymeerborstelstructuur vertoont een extreem lage elasticiteitsmodulus (2-3 kPa).Dit komt overeen met het vrijhangende uiteinde van de gevorkte polymeerborstel zoals weergegeven in de STEM-afbeelding.Hoewel er enig bewijs is van een modulusgradiënt aan de buitenrand van de CL, heeft het belangrijkste substraat met hoge modulus meer invloed.De bovenste 100 nm van het oppervlak ligt echter binnen 20% van de totale lengte van de vertakte polymeerborstel, dus het is redelijk om aan te nemen dat de gemeten waarden van de modulus in dit inspringdieptebereik relatief nauwkeurig zijn en niet sterk afhankelijk van het effect van het onderste object.
Vanwege het unieke biomimetische ontwerp van lehfilcon A-contactlenzen, bestaande uit vertakte PMPC-polymeerborstelstructuren geënt op het oppervlak van SiHy-substraten, is het erg moeilijk om de mechanische eigenschappen van hun oppervlaktestructuren betrouwbaar te karakteriseren met behulp van traditionele meetmethoden.Hier presenteren we een geavanceerde AFM nano-indentatiemethode voor het nauwkeurig karakteriseren van ultrazachte materialen zoals lefilcon A met een hoog watergehalte en extreem hoge elasticiteit.Deze methode is gebaseerd op het gebruik van een AFM-sonde waarvan de puntgrootte en geometrie zorgvuldig zijn gekozen om te passen bij de structurele afmetingen van de ultrazachte oppervlaktekenmerken die moeten worden bedrukt.Deze combinatie van afmetingen tussen sonde en structuur zorgt voor een verhoogde gevoeligheid, waardoor we de lage modulus en inherente elastische eigenschappen van vertakte polymeerborstelelementen kunnen meten, ongeacht poro-elastische effecten.De resultaten toonden aan dat de unieke vertakte PMPC-polymeerborstels die kenmerkend zijn voor het lensoppervlak een extreem lage elasticiteitsmodulus (tot 2 kPa) en een zeer hoge elasticiteit (bijna 100%) hadden bij testen in een waterige omgeving.De resultaten van AFM-nano-indentatie stelden ons ook in staat om de schijnbare contactmodulus/dieptegradiënt (30 kPa/200 nm) van het biomimetische lensoppervlak te karakteriseren.Deze gradiënt kan het gevolg zijn van het modulusverschil tussen de vertakte polymeerborstels en het SiHy-substraat, of de vertakte structuur/dichtheid van de polymeerborstels, of een combinatie daarvan.Er zijn echter verdere diepgaande studies nodig om de relatie tussen structuur en eigenschappen volledig te begrijpen, met name het effect van borstelvertakking op mechanische eigenschappen.Soortgelijke metingen kunnen helpen bij het karakteriseren van de mechanische eigenschappen van het oppervlak van andere ultrazachte materialen en medische hulpmiddelen.
Gegevenssets die tijdens het huidige onderzoek zijn gegenereerd en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de respectieve auteurs.
Rahmati, M., Silva, EA, Reseland, JE, Hayward, K. en Haugen, HJ Biologische reacties op fysische en chemische eigenschappen van oppervlakken van biomaterialen.Chemisch.maatschappij.Ed.49, 5178-5224 (2020).
Chen, FM en Liu, X. Verbetering van van mensen afkomstige biomaterialen voor weefselmanipulatie.programmeren.polymeer.de wetenschap.53, 86 (2016).
Sadtler, K. et al.Ontwerp, klinische implementatie en immuunrespons van biomaterialen in regeneratieve geneeskunde.National Matt Rev. 1, 16040 (2016).
Oliver WK en Farr GM Een verbeterde methode voor het bepalen van hardheid en elasticiteitsmodulus met behulp van indrukkingsexperimenten met belasting- en verplaatsingsmetingen.J. Alma mater.opslagtank.7, 1564-1583 (2011).
Wally, SM Historische oorsprong van het testen van indentatiehardheid.alma mater.de wetenschap.technologieën.28, 1028-1044 (2012).
Broitman, E. Indentatiehardheidsmetingen op macro-, micro- en nanoschaal: een kritische beoordeling.stam.Wright.65, 1–18 (2017).
Kaufman, JD en Clapperich, SM Oppervlaktedetectiefouten leiden tot overschatting van de modulus bij nano-indentatie van zachte materialen.J. Mecha.Gedrag.Biomedische wetenschappen.alma mater.2, 312-317 (2009).
Karimzade A., Koloor SSR, Ayatollakhi MR, Bushroa AR en Yahya M.Yu.Evaluatie van de nano-indentatiemethode voor het bepalen van de mechanische eigenschappen van heterogene nanocomposieten met behulp van experimentele en computationele methoden.de wetenschap.Huis 9, 15763 (2019).
Liu, K., VanLendingham, MR, en Owart, TS Mechanische karakterisering van zachte visco-elastische gels door inspringing en op optimalisatie gebaseerde inverse eindige elementenanalyse.J. Mecha.Gedrag.Biomedische wetenschappen.alma mater.2, 355-363 (2009).
Andrews JW, Bowen J en Chaneler D. Optimalisatie van visco-elasticiteitsbepaling met behulp van compatibele meetsystemen.Zachte materie 9, 5581-5593 (2013).
Briscoe, BJ, Fiori, L. en Pellillo, E. Nano-indentatie van polymere oppervlakken.J. Natuurkunde.D. Solliciteer voor natuurkunde.31, 2395 (1998).
Miyailovich AS, Tsin B., Fortunato D. en Van Vliet KJ Karakterisering van visco-elastische mechanische eigenschappen van zeer elastische polymeren en biologische weefsels met behulp van schokindrukking.Tijdschrift voor biomaterialen.71, 388-397 (2018).
Perepelkin NV, Kovalev AE, Gorb SN, Borodich FM Evaluatie van de elastische modulus en adhesiewerk van zachte materialen met behulp van de uitgebreide Borodich-Galanov (BG) methode en diepe indrukking.bond.alma mater.129, 198-213 (2019).
Shi, X. et al.Morfologie op nanoschaal en mechanische eigenschappen van biomimetische polymere oppervlakken van siliconen hydrogel contactlenzen.Langmuir 37, 13961–13967 (2021).